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評估血腦屏障結構的方法

時間:2019-06-29 19:46??? 瀏覽:
血腦屏障結構的評價主要依靠顯微鏡,如內皮細胞的形態、基底膜的完整性、內皮細胞結締組織蛋白的表達等。常用的技術有電子顯微鏡、熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡等。
1.電鏡:當血腦屏障受損時,透射電鏡下可觀察到一些典型的形態學和結構變化:毛細血管內皮細胞的連續性被打斷,內皮細胞內的小泡數明顯增加,內皮細胞間的緊密連接間隙擴大。掃描電鏡(SEM)主要用于證實體外血腦屏障模型的建立。基于透射電子顯微鏡的高分辨率,更適合于TJ、NVU等超微結構的研究。CNS內皮細胞獨特的脂類組成是BBB功能的基礎。應用透射電鏡觀察BBB損傷時細胞囊泡的表達。
2.熒光顯微鏡與免疫組化技術相結合,由于組織切片和圖像的主觀選擇和半定量分析,已成為觀察血腦屏障相關蛋白表達的重要技術手段,采用高分辨率共焦z疊操作系統模擬三維視野,克服了傳統熒光顯微鏡平面視野的局限性,定量熒光顯微鏡可以通過測量顱內腫瘤血管口徑,間接評價惡性腫瘤BBB通透性的變化。
3.激光掃描共聚焦顯微鏡:共聚焦顯微鏡利用激光束大大提高了超微結構成像的分辨率和選擇性,越來越多地用于血腦屏障的研究,但設備昂貴實用。
正常血腦屏障表現為低通透性和高阻抗。血腦屏障的功能通過檢測血腦屏障的通透性、血腦屏障的跨膜阻力以及血腦屏障連接蛋白和轉運體的表達來評價血腦屏障的功能。
4.染色和示蹤試驗:染料或放射性同位素作為示蹤劑長期用于評價血腦屏障的功能,常用染料有伊文思藍(evansblue,EB)、臺盼藍、辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)、熒光標記葡聚糖等,經EB灌注染色后,顯微鏡下觀察到血管周圍的紅色熒光,提示BBB損傷,并成功地應用于幾種轉基因小鼠和實驗性疾病模型中BBB通透性的測定。
鑭是一種電子密度較高的金屬,通常不能通過血腦屏障。聚焦超聲微泡打開血腦屏障后,鑭從內皮間隙漏出,橫向擴散到神經纖維。與傳統示蹤染料相比,鑭在鏡下更直觀地顯示血腦屏障的損傷。常用的放射性同位素標記物為[14C]α-氨基異丁酸、4-[18F]-氟安替比林等,但由于輻射污染,很少使用。
5.體外血腦屏障模型試驗:體外培養腦微血管內皮細胞和建立血腦屏障模型的方法在許多文獻中有報道,主要用于評價血腦屏障的功能,包括血腦屏障通透性、血管內皮細胞阻力、血腦屏障相關蛋白的表達等。FITC-葡聚糖通透性試驗:用異硫氰酸酯熒光標記葡聚糖.將培養的內皮細胞懸液接種于跨孔培養池中。FITC-葡聚糖被添加到細胞的上層,這些細胞已經聚集成單層。取基底膜上的細胞標本,用熒光酶標記儀檢測其熒光強度,評價血腦屏障(BBB)的通透性。
6.內源性血腦屏障損傷指數的檢測:由于通透性的增加,大量細胞、纖維蛋白原、免疫球蛋白、細胞因子和BBB蛋白由于通透性的增加而進入大腦。對21例格拉斯哥評分低于8分的重型顱腦損傷患者腦脊液(腦脊液)和外周血中S-100β水平進行了監測。結果發現,15例顱內壓>15 mmHg的患者,S≥10 0β明顯高于顱內壓<15 mmHg的患者。此外,當血腦屏障功能受損時,腦脊液中CLDN-5、OCLN、MMP-9和VEGF水平也有不同程度的升高。
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